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研究成果

研究成果


マイクロアレイの設計、作製と低分子RNAの発現解析

カスタムマイクロアレイ作製の概念図
図1　カスタムマイクロアレイ作製の概念図

50-100nt程度の低分子RNAの存在の普遍性及び、アンチセンス転写との関連性を解析するため、センス鎖とアンチセンス鎖の重なりを考慮した部分にプローブを設計したマイクロアレイを作製した（図1）。

ターゲットRNAはマウス脳からの低分子及び全RNAとし、全RNAに関してはラベル方法をrandom priming及びoligo dT primingの両方で行うことにより、ポリA鎖の付加されたRNAと共にポリA 鎖が付加されていないRNAも対象とした。低分子RNA/長鎖RNAのシグナル比や低分子RNAのシグナル自体の大きさからノーザン解析への候補を選んだ。なお、この課題については清澤と慶應義塾大学との共同研究として進めた。

ノーザン解析及び、機能解析への候補選定

ノーザンブロットの例
図2　ノーザンブロットの例
左パネル：ノーザンブロット。右パネル：メチレンブルー染色。レーン： 1. brain; 2. thymus; 3. heart; 4. lung; 5. liver; 6. spleen; 7. stomach; 8. intestine; 9. kidney; 10. Testis

SAT遺伝子座に由来するマウス新規低分子RNA（50-140 nt）候補50種類のうち、発現がノーザンハイブリダイゼーションにより確認されたものについて、配列を精査した（例、図2）。

この結果、新規性の高いもの2種類に絞り込んだ。一方、既に研究代表者らが既に発表済みのマウスcSAT-025の領域のAS2 RNAとS3 RNAについては、前者が脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、腸、精巣のいずれにおいても発現が確認できたのに対し、後者はいずれにおいても確認できず、発現パターンの違いを示すことがわかった。S3はNIH3T3細胞株での発現が確認されている。このことから、in vivoでは線維芽細胞で発現していることが期待される。残りの新規低分子RNA候補については脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、腸、精巣のいずれにおいても同程度の量の発現を示した。

RNA塩基配列データの構造的クラスタリング

マウス脳において発見された未同定低分子RNAの候補の一例
図3　マウス脳において発見された未同定低分子RNAの候補の一例
vsfoldによる推定二次構造を示した。

マウス脳から50-140 ntのRNA画分を調製し、次世代シーケンサーによる解析を行った。得られた約1億個のRNA配列について予測した二次構造および塩基配列によるクラスタリングを行い、これまでに51%がBoxC/D型のsnoRNA、42%がrRNAの断片、6%がその他の既知のRNAであることが判明している。現在、残りの約72万個のRNA配列について解析を進めている。なお、これまでに4つの未同定RNAを検出している。これらはいずれもイントロン内に位置し、哺乳類での保存性が高い領域であった（例、図3）。

雑誌論文

  • Dawson W and Kawai G: A new entropy model for RNA: part V, Incorporating the Flory-Huggins model in structure prediction and folding, J. Nucleic Acids Invest. in press.
  • Dawson W and Kawai G: A new entropy model for RNA: part IV, The minimum free energy and the thermodynamically most-probable folding pathway, J. Nucleic Acids Invest. in press.
  • Dawson W, Takai T, Ito I, Shimizu K, and Kawai G: A new entropy model for RNA: part III, Is the folding free energy landscape of RNA funnel shaped?, J. Nucleic Acids Invest. in press.
  • Dawson W, Yamamot K, Shimizu K, and Kawai G: A new entropy model for RNA: part II, persistence-related entropic contributions to RNA secondary structure free energy calculation, J. Nucleic Acids Invest. in press.
  • Dawson W, Yamamoto K, and Kawai G: A new entropy model for RNA: part I, a critique of the standard Jacobson-Stockmayer model applied to multiple cross links, J. Nucleic Acids Invest. in press.
  • Kohama C, Kato H, Numata K, Hirose M, Ogura A, and Kiyosawa H: An ES cell-differentiation system recapitulates a developmentally regulated neuron-specific parent-of-origin expressivity. Hum. Mol. Genet. 21, 1391-1401. 2012.
  • Saito R, Kohno K, Okada Y, Osada Y, Numata K, Kohama C, Watanabe K, Nakaoka H, Yamamoto N, Kanai A, Yasue H, Murata S, Abe K, Tomita M, Ohkohchi N, and Kiyosawa H: Comprehensive expressional analyses of antisense transcripts in colon cancer tissues using artificial antisense probes. BMC Medical Genomics 4, 42, 2011.
  • Hokii Y, Sasano Y, Sato M, Sakamoto H, Sakata K, Shingai R, Taneda A, Oka S, Himeno H, Muto A, Fujiwara T, and Ushida C: A small nucleolar RNA functions in rRNA processing in C. elegans. Nucleic Acids Res. 38, 5909-5918, 2010.

学会発表

  • 河合剛太、牛田千里、清澤秀孔：マウスSAT領域から発現する50-100残基RNAのクラスタリングと構造解析、第84回日本生化学会大会、京都、2011年9月.
  • Kawai G, Ushida C, and Kiyosawa H: Analysis of Small RNAs, with 50-100 nt Length, from the Loci of the Sense-Antisense Transcription in Mouse Genome, The 16th Annual Meeting of The RNA Society, Kyoto, June 2011.
  • Ushida C, Ono T, Saito R, Osada Y, Shindo Y, Kaneko N, Kawai G, and Kiyosawa H: Expression of small RNAs from mouse SAT loci, The 16th Annual Meeting of The RNA Society, Kyoto, June 2011.
  • 斎藤裕之、伊谷野悠里、牛田千里、清澤秀孔、河合剛太：NMR試験管内転写によるRNAのNMRスペクトルの測定、第49回NMR討論会、東京、2010年11月.

図書

  • Kohama C and Kiyosawa H: Genome-wide analysis of sense-antisense transcripts, in "Non-coding RNAs and Epigenetic Regulation of Gene Expression: Drivers of Natural Selection," pp. 3-29, Morris KV （ed.）, Caister Academic Press, Norwich, U.K., 2012.
  • 河合剛太、清澤秀孔編：「機能性RNAの分子生物学」、クバプロ、2010
  • 牛田千里 他、：「機能性RNAの分子生物学」、第I章、第II章、第IV章、クバプロ、2010．
  • Ushida C and Hokii Y: Isolation and characterization of small RNAs in Caenorhabditis elegans. in "Regulation of Gene Expression by Small RNAs," pp. 101-121, Rossi J and Gaur RK （ed.）, CRC press, 2009.

産業財産権

名称：低分子RNAの分析方法
発明者：牛田千里
権利者：青森県弘前市文京町1番地国立大学法人弘前大学
種類：特許
番号：第4599555号
取得年月日：2010年10月8日
国内外の別：国内